引言：

科研人员采用了抑制减法杂交的方法，来阐明卷心菜感染黄单胞菌后引发黑腐病原体抗性的机制，他们选择了卷心菜抗性品种Pusa mukta，并构建了一个富含差异表达转录本的cDNA文库。

目前的研究结果显示，在所研究的单基因中，与防御相关的单基因占总数的35%，科研人员通过半定量RT-PCR确认了与防御特异性相关的基因，并揭示了这些基因在抗性品种中的表达增加，不过问题在于，抗性品种在受到黑腐病细菌病原体攻击时，会引发强烈的超敏反应。

本项研究的目的是，评估卷心菜抗性品种对黑腐病细菌病原体的抗性，研究结果有助于揭示卷心菜抗性机制的细节，为改良和培育更具抗性的卷心菜品种提供基础。

显性种族特异性基因定位

黑腐病，是由黄单胞菌引起的，特别是在温暖潮湿的季节，病原体通过包虫进入植物并在叶和茎的脉管系统中扩散，黑腐病的典型症状是出现V形叶状病变，顶点朝向叶片的中肋。

长期以来，黑腐病品种的开发和使用，一直被认为是控制该病的重要方法，主要基因抗性的遗传已经在二倍体B. rapa（A基因组）和四倍体B. carinata（BC基因组）和B. napus（AC基因组）中进行了研究。

科研人员发现，一个显性种族特异性基因，被定位到卷心菜双歧杆菌的A基因组中。

为了达成对黑腐病的持久抵抗力，科研人员发现可以通过基因赋予的方式，为了实现这一目标，来自野生近缘拟南芥的基因，可能更容易和更快地进行分子表征，并且可以直接用于转基因卷心菜作物，或者促进同源黑腐病抗性基因，从A或B基因组来源的鉴定和种间转移到蔬菜作物中。

有趣的是，关于拟南芥（一种常用的实验模型植物）对Xanthomonas pv（一种植物病原菌）的抗性的研究，大多数拟南芥种质，对一个或多个X. pv种族表现出抗性，其中，Campestris种族展示了对该病原菌所有主要种族的广谱抗性，这意味着拟南芥的这些野生近缘种，可能是提供持久的黑腐病抗性的有用来源。

防御相关酶具有广泛的作用谱活性，并在植物-病原体相互作用中起关键作用，过氧化物酶是植物生化防御病原微生物的最重要因素之一，积极参与感染后植物代谢的自我调节，过氧化物酶活性与发病机制有关，进而导致酚类化合物强化细胞壁。

研究人员在识别卷心菜对病原菌的防御机制方面进展缓慢，可能涉及到一系列复杂的生化过程和基因调控网络，科研人员通过将卷心菜接种抗性病原菌（X. campestris pv）进行实验，从而了解卷心菜对该病原菌的抗性机制，以及相应的基因表达和蛋白质变化。

研究人员还开展了，对易感寄主植物的功能基因组学和蛋白质组学研究，希望了解易感寄主植物，对病原菌的感染过程中相关基因和蛋白质的变化，从而揭示病原菌与宿主之间的相互作用机制。

抑制减法杂交（SSH）是一种基于PCR的方法，用于生成无偏cDNA文库，其目的是扩增差异表达的cDNA，测试者群体的cDNA文库经过变性处理，使其成为单链，这个cDNA文库包含了测试者群体中差异表达的基因。

然后再让测试者群体的目标cDNA文库，与过量存在的驱动cDNA群体进行杂交，这两个群体的cDNA会互相退火，即在适当的温度下结合，在杂交过程中，共同的片段会互相结合，形成双链DNA，而测试者群体特异的产物则会保持单链状态。

通过PCR扩增单链的测试者群体特异产物，这些产物代表了差异表达的基因，这些特异产物可以用于生成表达序列标记（EST），进一步研究和分析差异表达的基因。

本研究涉及分离与卷心菜中黑腐病病原体抗性的基因，抑制减法杂交方法在超敏反应（HR）的早期阶段，用于生成富含卷心菜叶中表达序列的cDNA文库，该研究通过分析受病原体攻击的抗性卷心菜品种Pusa mukta中的基因表达情况，探索了卷心菜与黑腐病病原体之间的相互作用。

大量植物基因在受到病原体的攻击时受到转录调节，大多数基因在相容和不相容的互作用中都扮演着共同的角色，该研究的目的是，提供一个重要的基因组资源，以帮助研究人员更好地了解卷心菜和黑腐病病原体之间的相互作用，这些防御基因的研究，有助于揭示植物抗病机制并为农作物的抗病育种提供参考。

抑制减法杂交的实验经过

抑制减法杂交的方式就是，在接种后12、24和48 h内收获卷心菜叶，然后接种黄单胞菌pv，但UOMBT-6分离物会引起不相容的相互作用，所以需要使用RNeasy植物试剂盒分离总RNA。

科研人员通过在紫外-可见分光光度计中，测量2000nm处的吸光度来确定RNA产量，并通过3.1%琼脂糖凝胶电泳2μg总RNA检查RNA完整性，使用mRNA纯化试剂盒从总RNA中纯化聚，这个过程全都是使用PCR选择cDNA减法试剂盒进行。

后续科研人员又用Rsa I，在含有400单位酶的40μl反应混合物中，在30°C下消化约4ng测试器和驱动cDNA，使用MinElute反应净化试剂盒纯化限制性cDNA片段，并在37μl无菌水中从MinElute色谱柱中洗脱，将消化的测试仪cDNA（10μl）稀释在1μl水中。

然后将5μl等分试样稀释的测试仪cDNA，连接到2μl接头2（1μM）或10μl接头2（1μM）的单独连接反应中，总体积为10μl，在10°C下过夜，使用两个单位的T4DNA连接酶，在缓冲液中连接后，将反应在72°C下加热5分钟以使连接酶失活。

在完成上述过程之后，再将1.5μlds cDNA和1μl杂交缓冲液加入到，分别含有1.5μl适配器1和适配器2R连接测试仪cDNA（1：10）稀释的两个试管中，将溶液覆盖矿物油，使DNA变性（1.5分钟，98°C），然后在12°C下退火68小时。

在第一次杂交之后，将两个样品合并，并在100μl杂交缓冲液中加入新鲜部分的热变性驱动器（1ng），将样品在16°C下杂交68分钟，并在-7°C下储存直至使用，在正向和反向减法实验中，测试仪与驱动器的最终比率均为20：300，最后对正向和反向减去的cDNA样品进行六次单独的抑制PCR扩增反应。

研究中使用的十个卷心菜品种，科研人员对它们都根据黑腐病发病率的外观进行分类，范围在4%至66%之间，其中Pusa mukta品种的疾病发病率为3%，因此被认为是抗性品种，还有Indam krishna、Gaurav、Indam saina、Unnati和NS 43等五个品种具有中度抗性（6-14%），Golden Acre和Quisto这两个品种对黑腐病较为敏感（30-33%），剩余F1 bhima和NBH boss这两个品种，在温室条件下对黑腐病高度敏感（63-66%）。

为了验证上述的实验结果，科研人员又选择了24个防御相关单基因过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，发现它们表现出较高的同源性百分比，并且会影响黄单胞菌感染过程中，在抗性和易感品种中的表达。

通过比较对照基因18S rRNA、48S rRNA，发现两种基因在两个品种中均有表达，其中抗性品种中防御基因的表达较高，与易感品种相比，抗性品种中过氧化物酶的表达更高。

在抗性品种Pusa mukta中接种病原体（hpi）后18 h，SOD活性较高，在400 h时发现活性为18单位，而在高度敏感的品种中，SOD活性在190 hpi时为21单位，上述结果均能通过原生页面分析得到证明。

结论：

科研人员从大量的卷心菜样本中鉴定出500个差异表达的基因，然后使用抑制减法杂交技术，对卷心菜进行了基因表达分析，通过这种技术，研究人员从150个随机挑选的卷心菜个体中获得了500个单基因，结果发现这些卷心菜基因的80%，均具有生物学功能的EST（表达序列标签）。

通过上述实验研究，结果表明，卷心菜中过氧化物酶的积累与其对黑腐病的抗性水平呈正相关，过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等单基因，在卷心菜中与黑腐病抗性相关，这些发现为进一步研究和利用，与卷心菜黑腐病抗性相关的基因，提供了有益的线索和候选基因。

参考文献：

费尔南德斯，帕特里夏，《抑制减法杂交：一种产生差异调节或组织特异的方法》

郭迪克森，亨特，《拟南芥在全身获得性耐药期间的转录组》

辛普森，约翰逊，《卷芯菜中黑腐病、霜霉病和凝乳枯萎病的抗性育种》