利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。cDNA 文库不同于基因组文库，被克隆的 DNA 是从 mRNA 反转录来源的DNA，组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列，因此进行 cDNA 克隆时应先从获得 mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与 mRNA 相互补的 DNA 链，然后除掉mRNA，以第一条 DNA 链为模板复制出第二条 DNA 链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。
cDNA文库的特点
1. 基因特异性
来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表正在表达的基因的遗传信息。
2. 器官特异性
不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。
3. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。
4. 不均匀性
在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。
5. 各cDNA均可获得表达
cDNA 文库的构建流程
1. RNA提取：从组织或细胞中提取RNA。
2. 逆转录：利用逆转录酶将RNA转变成cDNA。逆转录酶可以用几种不同的方法，包括反转录PCR方法和反转录特异性引物的方法。
3. 双链cDNA合成：将一端的oligo dT引物与头部的mRNA低复杂度区域杂合，随后，通过使用逆转录酶(polymerase)来合成第一条链，然后再合成第二条链，以得到双链cDNA。
4. 手工或机器克隆：将cDNA克隆到载体中。手工克隆使用限制性内切酶和连接酶来插入cDNA，而机器化克隆则使用高通量自动克隆技术。
5. 筛选：初步筛选文库，以分离包含所需基因的克隆。
6. 验证和测序：最后，通过验证所得克隆的插入片段的尺寸和序列，并使用测序技术对其进行测序。